神外专题十一悦灵胶促进急性完全横断性脊

纤维蛋白胶促进急性完全横断性脊髓损伤修复的初步研究

首都医院神经外科

李荧赵奇煌

摘要

目的：探讨纤维蛋白胶（fibringlue，FG）对完全横断性脊髓损伤修复和再生的影响。

方法：取健康雌性SD大鼠10只，体重～g，制备急性完全横断性脊髓损伤模型。随机将其分为实验组和对照组，每组5只，实验组脊髓断端注入FG（μL/只），对照组不予任何治疗。术后4周，采用BBB运动评分法进行运动功能评价。术后4周处死动物，应用免疫组织化学方法观察神经中丝（neurofilament，NF）和神经胶质纤维酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein，GFAP）表达。采用图像分析方法，对脊髓横断处远、近端进行神经纤维计数及GFAP面积比分析。

结果：BBB运动评分：对照组（2.40±0.51）分，实验组（3.00±0.45）分，两组间运动功能比较差异无统计学意义（P0.05）。免疫组织化学观察示，对照组近、远端可见少量NF阳性细胞和GFAP阳性结构；实验组近、远端可见大量NF阳性细胞及GFAP阳性结构生长，并向损伤中心区汇聚，但未到达中心区。图像分析显示，神经纤维数量：实验组近端（.10±20.75）根、远端（73.60±33.61）根，对照组近端（45.50±17.18）根、远端（23.50±8.20）根；GFAP面积比：实验组近端33.75%±11.06%、远端27.75%±7.15%，对照组近端23.78%±5.76%、远端19.78%±5.17%；实验组与对照组比较差异均有统计学意义（P0.05）。

结论：FG对脊髓损伤具有一定程度的修复及促进其再生的作用。

Kao等（）发现影响脊髓损伤神经再生的重要因素之一是缺乏适宜的再生环境与支持结构；另外，脊髓损伤后由于自身生物力学作用，发生弹性回缩是另一重要影响因素。因此，减低脊髓损伤早期的病理改变，为脊髓损伤断端提供相对密闭的环境，降低脊髓弹性回缩是关键问题。我们的实验通过将纤维蛋白胶（fibringlue，FG）直接应用于脊髓断端，探讨FG对脊髓损伤修复再生的影响。

1材料与方法

1.1实验动物及主要试剂、仪器

健康雌性SD大鼠10只，体重～g，由首都医科大学动物科学部提供。神经中丝抗体（anti-neurofilament，anti-NF）、神经胶质纤维酸性蛋白抗体（anti-glialfibrillaryacidicpro-tein，anti-GFAP），均购自北京博奥森生物技术有限公司；DMLA显微镜、QWIN图像统计分析系统（Leica公司，德国）。

1.2完全横断性脊髓损伤动物模型制备及分组

6%水合氯醛（6mL/kg）腹腔麻醉后，常规备皮，将大鼠固定于鼠板，外科消毒铺巾。沿T8～T11椎皮肤纵行切口，钝性分离筋膜、椎旁肌肉，暴露T9、10，显微镜下以显微外科剪将T9、10原位完全横断，稍向两侧牵拉至可清晰见到腹侧硬脊膜，确保脊髓完全横断。将动物随机分为实验组及对照组，每组5只。实验组于脊髓断端间注射FG（μL/只），对照组不予任何治疗。分层缝合肌肉和皮肤，碘酒消毒伤口，术毕。术后给予青霉素20万U/次，2次/d。按摩膀胱2次/d，至膀胱排尿反射功能恢复。

1.3检测指标

1.3.1运动功能评价

采用BBB运动评分法[1]，术后4周观察动物的臀、膝、踝关节、行走、躯干运动及其协调情况。T9、10脊髓运动功能主要观察：后肢运动（后肢髋关节、膝关节和踝关节活动），后肢能否支撑体重，前后肢协调运动，爪子的精细运动等。

1.3.2免疫组织化学染色

术后4周将两组大鼠心脏灌杀固定，取脊髓标本。随后加入30%蔗糖PBS液，4℃过夜。于脊髓损伤中心处向近、远侧端各7mm纵行、连续冰冻切片，厚20μm。采用SP免疫组织化学染色法，Leica-DMLA显微镜下观察NF阳性纤维数目及GFAP阳性细胞构建的神经胶质网架结构。

1.3.3图像分析

采用Leica-DMLA显微镜及Leica-QWIN图像统计分析系统，分别对脊髓纵切片距损伤中心部位近端4mm及远端4mm区域内，用免疫组织化学染色的所有横断脊髓远、近端切片进行神经纤维计数，并进行GFAP面积比定量分析。

1.4统计学方法

采用SPSS11.0统计软件包进行分析。实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，P值0.05为有统计学意义。

2结果

2.1运动功能评价

两组后肢均可见1个或2个关节的轻微运动，通常是髋关节；后肢均不能负重，后肢及尾部呈拖动状态，不能产生任何步态。BBB运动评分，对照组（2.40±0.51）分，实验组（3.00±0.45）分，两组间比较差异无统计学意义（P0.05）。

2.2免疫组织化学染色

对照组损伤近端NF阳性纤维数少、弯曲、不连续（图1a）；损伤远端NF阳性纤维数目较近端减少（图1b）；损伤中心NF阳性细胞消失。实验组损伤近、远端NF阳性纤维数目均较对照组增多，染色增强（图1c、d）；损伤中心均可见少量弯曲、不连续的神经纤维向瘢痕方向生长，但未能到达或穿透瘢痕组织。

对照组损伤中心区周围可见少量GFAP阳性细胞突起；损伤近、远端的突起之间构成网络，量少，形成空洞与微囊的边界（图2a、b）。实验组损伤近、远端神经胶质网架结构较对照组明显增多，其网架结构向损伤中心区延伸，但未能达到中心区（图2c、d）。

2.3图像分析

两组损伤近、远端神经纤维数量及GFAP面积比见表1。实验组损伤近、远端神经纤维数量和GFAP面积比与对照组比较差异均有统计学意义（P0.05）。

3讨论

多年来，随着对脊髓损伤研究的日益深入，人们认识到脊髓功能的丧失除了与其病理改变直接有关外，还与缺乏适宜的再生环境以及脊髓自身的张力有关[2-8]。脊髓生物力学特性使脊髓损伤后，在周围组织作用下发生自身弹性回缩，使损伤间隙加大，脊髓断面吻合时张力加大，影响愈合。Breige等（）通过尸体及动物实验，发现脊髓生理弹性伸展，不论时间长短，均可阻碍脊髓断端神经组织再生。

FG是组织封闭剂的一簇，是由血浆制成的复合物，主要成分为纤维蛋白原和凝血酶，是经严格检疫的哺乳动物血液中提取，经灭菌消毒，冻干制成，不含致热源，具有良好的组织相容性和完全的降解吸收性。FG中的纤维蛋白原长丝状分子在凝血因子ⅩⅢ的作用下交联成网状结构的纤维蛋白，形成半透明的胶冻状物，不仅具有较强的黏着性，而且在FG网格间允许营养物质自由通过。FG具有黏附和药物携带功能，葛薇等[9]利用FG携带BMSCs，在动物体内构建可注射性组织工程软骨；张长青等（）在周围神经损伤修复中，利用FG凝胶黏合，加外膜固定修复周围神经，取得良好效果；黄启顺等[10]通过FG黏合修复周围神经抗牵拉强度动态变化，结果表明FG有足够的抗牵拉强度，可满足大鼠神经修复的需要；Robinson等[11]报道FG本身可直接促进损伤轴突再生。FG的特殊功能为脊髓损伤的修复开辟了新的治疗研究领域[11-16]。

我们设计利用黏合修复脊髓横断的原理是：将FG充填并覆盖脊髓断端，利用FG作用于脊髓断端，对脊髓断端施以局部牵拉，在神经纤维断端间形成外束力，减少脊髓横断后的应力回缩。FG在脊髓断端形成凝胶环，有“再生室样”的作用，形成相对密闭的环境；同时，FG可迅速封闭脊髓断端，减少轴浆溢出，进而减少相关病理反应的发生；同时FG可迅速止血，减少脊髓断端出血以及继发引起的缺血、防止瘢痕形成。另外，FG特有的网格结构可以为神经纤维的生长提供支架作用，允许神经纤维的生长穿行其网格间。

我们的实验结果显示，实验组损伤近、远端神经纤维数量明显多于对照组（P0.05），表明FG具有促进神经纤维再生的作用。其原因可能是在FG构筑的再生室效应下，对脊髓损伤断端间的封闭及保护作用；同时从另一个角度说明了外界因素对脊髓损伤后神经纤维再生的影响。实验组损伤近、远端GFAP面积比明显大于对照组（P0.05），表明FG所形成的“再生室样”效应同样对神经胶质细胞具有促进生成作用。

神经胶质细胞在正常情况下对神经纤维具有保护和支持作用，在脊髓损伤后的病理改变及轴突再生中起重要作用[17]。脊髓损伤发生后，在神经纤维受损伤的同时，由神经胶质细胞构筑的支架结构也遭到破坏。神经胶质细胞对脊髓损伤后促进神经再生起重要作用[18-19]，脊髓损伤后的神经再生困难是由于缺乏适宜的再生环境与支持结构，不能使神经纤维持续地再生生长[20]。FG构筑的“再生室样”效应可加速神经胶质细胞网架的构建，由于其对神经纤维具有营养作用，因此有利于神经纤维的再生。但由于神经胶质细胞形成的胶质瘢痕，会对神经纤维的后期再生起阻碍作用[21]，因此还有待于进一步研究。

我们的实验中，实验组有少量神经胶质细胞构筑的网络支架分别从损伤近、远端伸向损伤中心区，这也许会为神经纤维的再生延伸构筑支架；但在NF染色中并未见神经纤维在其间生长，这也许与神经纤维和神经胶质细胞不同的生长速度、需求的神经营养环境等多因素有关；另外，也许和神经胶质细胞瘢痕对神经纤维再生的阻碍作用有关，还有待于进一步研究。

我们的研究表明，FG通过对脊髓损伤急性期断端的封闭作用及机械牵拉，可在一定程度上达到促进损伤脊髓神经修复乃至促进神经纤维再生的功效。

参考文献（略）