脊髓损伤的基因治疗

　　长期以来，医学家一直在努力探索脊髓损伤后的机能恢复治疗，但成效甚少。晚近，经过多年的研究发现脊髓损伤后仍存在一定再生能力^（1），脊髓损伤后之所以不能恢复功能，系因损伤局部微环境的影响，它包括：(1)缺乏促进轴索生长的神经营养因子(ngfs)；(2)缺乏支持和引导神经生长的雪旺氏细胞(sc)、基板、神经膜管、bunger带和细胞外基质；(3)成熟后的少突胶质细胞、星形细胞表面存在特异性蛋白ni-250，均系与髓鞘相关的轴索生长抑制性物质；(4)脊髓损伤局部有胶质增生及瘢痕形成，阻碍神经纤维的再生和伸延；(5)其它影响神经再生的调控因素的匮乏如：生长相关蛋白(gap-34)、及早反应基因(iegs)、降钙素基因相关肽(cgrp)、cl-2及c-jun等。因此脊髓损伤后功能恢复，必须具备两个基本条件，其一是有脊髓内源性神经纤维再生的基础，其二是提供一个能够促进神经纤维再生的微环境。换言之，前者就是在受损区需有尚存活的、并具有生长潜能的神经元，后者为能提供神经生长基因的受体细胞，以促神经纤维生长、延伸、连接及功能重建^（2）。

　　一、促脊髓再生的神经营养因子(ntf)

　　ntfs是一类由神经元、神经支配的靶组织及胶质细胞产生的神经营养因子，是有促进中枢和外周神经系统细胞分化、生长和存活作用的活性蛋白，现已知有20余种，但其中在体内和离体情况下均能促进神经生长作用者，仅有神经生长因子(ngf)、脑源性神经营养因子(bdnf)、睫状神经营养因子(cntf)、神经营养素-3(nt-3)、神经营养素-4／5(nt-4／5)及碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)等数种。据kdiatsos等(1990)报道，脊髓损伤后局部神经生长因子受体(ngfr)的表达显著增多。oudega等(1996)将外源性ngf和cntf注射到脊髓损伤区，获得神经轴索明显再生的效果^（3）。有作者将高效的ntfs基因先转染给适当的受体细胞，然后再植入脊髓损伤区，使ntfs在体内继续表达，以促进脊髓神经纤维再生。tuszyns-ki等(1994)曾将重组ngf病毒载体转染给成纤维细胞，然后植入鼠脊髓的损伤区，获得较多的感觉神经元轴索生长，并持续有ngf表达1年之久^（4）。为了研究外源性ngf对脊髓再生的作用，oudega和hagg(1996)曾用外源性ngf加神经移植的方法研究脊髓损伤后轴索的再生，结果于2周内ngf组轴索生长长度超过对照组3mm^（3）。

　　关于ntfs对脊髓损伤的再生修复机理及其发挥生物学效应的原理，目前虽未阐明，但经多年的研究，现已知ntfs有低亲合力受体(ingfr)和高亲合力受体(hngfr)两类，前者是富含半胱氨酸的跨膜糖蛋白，后者为具有酪胺酸激酶活性的跨膜糖蛋白，二者均与ngf、nt-3及n-4／5有关，其中以hngfr为甚。brunell等(1990)用northern斑点杂交法分析鼠胸脊髓损伤后的脊髓总rna以确定ngfrmrna含量，结果发现：伤后4天伤区脊髓ngfrmrna含量明显升高，伤后7天达峰值，并且高于对照组6～7倍之多，甚至于伤后2～4周时仍高出4倍，说明脊髓损伤能诱导脊髓神经元表达ngfr。因而多数学者认为：注射ngf至脊髓损伤区可使之与受损脊髓神经元轴索的ngfr结合形成复合体，并能被逆行转运到神经元细胞体内，进一步发挥其促神经再生修复的生物效应。有作者认为ntf对脊髓损伤的再生修复作用，可能是先与神经元细胞膜、胞浆轴索上的受体特别是hngfr产生高选择性的结合，继而调控神经细胞内相关的细胞因子及钙离子的重新分布，改善损伤区的微循环，使之适于脊髓神经的恢复而提高再生修复的机能^（5）。除此之外，ngf尚有减少超氧化自由基对脂质膜的损害，有促蛋白磷酸化的作用和调节受损脊髓前角运动神经元的mrna转录功能，有助于脊髓的修复。

　　为了向脊髓损伤区提供足够的、持久的神经营养因子，最佳的途径就是转基因。目前所应用的转基因技术，是以腺病毒为载体，先将外源性基因重组至病毒dna，然后再转染受体细胞，最后植入受损脊髓中，使之不断提供目的基因，发挥治疗作用。据montgoinery等(1996)报道，脊髓损伤后的再生与修复需要三个基本条件：(1)尚有存活的神经元以保证轴索再生所需要的结构和功能性物质；(2)轴索再生的长度必须达到受损区的远侧端；(3)轴索应对位连接至相应的靶组织，始能有功能的重建^（6）。

　　二、受体细胞(sc)

　　能够携带ntfs基因的受体细胞有多种，除sc之外，还有成纤维细胞、肌母细胞^（4）等，甚至有作者采用重组病毒载体直接感染载体细胞，而不通过受体细胞植入受损区域，例如直接转染神经元和胶质细胞，或经颈内动脉注射重组病毒载体，使之通过损坏的血脑屏障转染神经细胞^（7），或经蛛网膜下腔注射，使随脑脊液循环转染至室管膜细胞，从而表达产物，促进受损cns得以再生修复。最早采用sc作为ngf转染的受体细胞，进行脊髓损伤基因治疗的作者是tuszunski等(1994)，他们认为sc在体内能稳定表达ngf，并能促轴索再生。我院神经外科研究(1997)也曾用sc作为受体细胞进行脊髓损伤基因治疗研究，取得一定成效，认为sc是符合受体细胞的基本要求的。选择受体细胞的理想条件是：(1)易于获取并能在体外培养繁殖；(2)经转基因修饰后植入损伤区仍具有生存和分化的能力；(3)在神经胶质界膜(glial limiting membrane)受损时，能进入cns发挥其象在外周一样促进轴索再生的作用；(4)能较长时间表达所携带基因而不衰减；(5)无显著的免疫原性，不被排斥；(6)不会无节制地浸润生长形成肿瘤；(7)还具有分泌细胞外基质成份的功能。sc不仅有分泌ngf、bdnf、cntf等多种ntfs的作用，同时尚有分泌细胞外基质成份如：层粘蛋白(ln)、纤维连接蛋白(fn)和细胞粘连分子(cam)的作用^（8，9）。由于sc已具备防止受损神经元胞体继发性死亡和促轴索再生的先决条件，故而采用sc作为受体细胞的研究者亦为数较多。wangzihui等(1996)利用免疫组化和电钳，对21例脊髓损伤后死亡病人进行检测和观察，发现损伤脊髓的轴索再生处均有sc表达的ngfr，提示脊髓损伤后sc可以将ngf传递给轴索，不仅能沿轴索向远端引导其生长锥寻找相应的靶组织，而且也能向近端转送至神经元胞体，促进cns细胞再生。另外，据严恒林等(1996)报道sc分泌的cntf尚可至细胞间隙为神经元所用，并有诱导运动终板区轴索及其相邻的郎飞氏节发芽(spouting)的能力。不仅如此，近年来的研究还发现：(1)sc有减轻神经胶质瘢痕(glial scar)及缩小创腔的作用，据frisen等(1995)研究证实sc分泌的细胞外基质(ecm)中的层粘蛋白能降解胶质瘢痕中阻碍轴索生长的含蛋白多糖硫酸酯软骨素(gs-pgs)，故而有利于轴索穿过胶质瘢痕^（10）；(2)sc可以在脊髓损伤的启动下合成生长相关连蛋白-43(gar-43)该物具有提高细胞内骨架蛋白及生长锥形成的作用。

　　三、基因治疗脊髓损伤的基础

　　基因治疗的首要步骤是转导基因的分子构建，通常转导基因应由目的基因cdna、启动子／增强子及载体等部分组成。目的基因重组时除本身特有的(cdna)序列外，还需进行必要的修饰(modifica-tion)，如转录起始修饰、翻译起始修饰、内含子与聚腺苷酸化信号等。用于重组的启动子／增强子一般有三种：强组成型(strong constitutive)、管家型(housekeeping)及组织特异型(tissue specific)启动子，以第一型最为常用^（11）。其次是转移载体的选择，理想的体内基因转移载体要求，应为：(1)转移具有细胞靶向性；(2)导入基因的表达具有可控性；(3)转移的方法简便易行。目前，用于脊髓损伤的基因转移载体主要是采用免疫性较小的逆转录病毒(retrouirac vector)^（2）。构建转录病毒载体的基本原理是：病毒的长末端重复序列(ltr)可以对插入的外源基因进行有效的转录，故可先在体外将外源基因重组到病毒dna，再用酶专法去除基因组中的反式作用区域，如含gag、pol、env基因区域，保留其控制感染和整合的序列，即顺式作用区域，形成缺陷型逆转录病毒。这种复制缺陷型病毒载体还须依靠包装，产生带有外源基因的伪病毒。它能感染受体细胞，则载体dna将依靠其长端重复序列(ltr)整合入受体细胞的染色体基因组中，为此，最终外源基因被带入宿主细胞并得以表达^{（2，4，11，12）}。

　　四、基因治疗脊髓损伤的前景

　　自从1994年美国加利福尼亚大学tuszynski等将ngf基因转导至培养的sc，并植入受损脊髓之后，已有许多基因治疗脊髓损伤的实验和研究报道。1995年另一作者，senut和与tuzsynski采用人神经营养素-3(hnt-3)转染成纤维细胞后，植入脊髓损伤区，亦获轴索出芽生长的效果^（13）。随 后1996年hjichi等又将血小板源生长性因子(pdgf)导入脊髓病损区，探讨治疗放射性脊髓损伤的方法^（14）。1997年blesch等采用ngf基因转移治疗慢性脊髓损伤，于损伤后1～3月始植入转染ngf基因的细胞，发现移植区明显的基因表达及轴索生长^（15）。同时，我院将psvpomcat基因修饰的sc移植入大鼠损伤脊髓内，并证明有减轻脊髓继发性损害、抑制神经细胞凋亡，且对脊髓组织形态与功能具有一定修复作用。纵观1994年以来的不同报道，均获得相似的结果，提示基因治疗脊髓损伤无论是急性外伤，还是晚期病变都存在诱人的前景。

　　不过利用基因转移治疗脊髓损伤，还存在一些有待解决的问题，首先是免疫排斥反应^（16），虽然cns是所谓免疫豁免区，但并非绝对没有免疫应答能力，对抗原性强的或种属相差较远的受体细胞，还是存在排斥反应。其次是移植细胞存活的时程是否够长的问题，因为在细胞移植区存在宿主内源性细胞系统对受损组织局部的病理生理反应，可能造成部分或全部移植细胞死亡。最后是基因修饰细胞植入宿主后，其基因表达强度可随时间的延长而逐渐衰减，甚至失去治疗作用。因此，今后应着眼于内源性及外源性调节因子的主动调控转移基因方面进一步深入研究，才能切实提高基因治疗脊髓损伤的效果^（17）。