实验研究转TrkC基因NSCs移植联

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本文刊于：岭南心血管病杂志，,22(05):-

作者：丁皓，朱平，陈寄梅，黄焕雷，卢聪，陈志衡，蔡骞，赵明一　　　　　　

目的

研究转酪氨酸激酶C(tyrosinekinaseC，TrkC)基因神经干细胞(neuralstemcells，NSCs)移植联合神经营养素(neurotrophin,NT)-3局部应用对大鼠脊髓缺血再灌注损伤的治疗作用及微管相关蛋白-2（microtubuleassociatedprotein-2，MAP-2）表达的变化。

方法

90只Wistar大鼠，雌雄不拘，清洁级，～g，随机分为6组（每组15只），分别为正常对照组（A组）、缺血再灌注损伤模型组（B组）、NSCs移植组(C组)、NSCs移植+NT-3局部使用组(D组)、转TrkC基因NSCs移植组(E组)和转TrkC基因NSCs移植+NT-3局部使用组(F组)。于左锁骨下动脉末梢处予降主动脉缠胶带法建立脊髓缺血损伤模型，50min后，阻断的降主动脉被解除。术后第1天进行细胞移植。各组大鼠分别于细胞移植后6h、24h及48h进行脊髓运动功能评分。术后24h、1周，分别处死7和8只大鼠，迅速取出脊髓标本，HE、NISSLE染色观察神经元形态学变化，免疫组织化学法观察MAP-2的表达变化，实时定量PCR法检测MAP-2mRNA的表达变化。

结果

与缺血模型组（B、C、D、E组）和其他移植处理组相比，F组大鼠脊髓运动功能恢复情况最佳，脊髓神经元核溶解程度较轻，神经元结构相对完整，数量也较多，MAP-2表达增加；与对照组（A组）和缺血模型组（B组）相比，各移植处理组MAP-2mRNA表达均有不同程度的增加，并且，F组MAP-2mRNA表达增加最为明显，与其他各组相比，差异具有统计学意义（P0.01）。

结论

在局部给予的NT-3作用下，转TrkC基因NSCs对脊髓缺血再灌注损伤具有较好的治疗作用，其可能的机制是通过上调MAP-2的表达实现的。　　　　　　

脊髓损伤的治疗是临床面临的一个重大难题，如在心脏大血管手术中，主动脉阻断易造成脊髓缺血再灌注损伤（spinalcordischemia-reperfusioninjury，SCII），发生率为2.4%～40%[1]，重者可致截瘫[2]。目前治疗方法主要以药物治疗、手术治疗及物理疗法为主，但是效果都不尽理想。自从年Reynolds和Weiss首先从小鼠纹状体中分离而获得神经干细胞以来，神经干细胞的研究为脊髓损伤这一医学难题带来了新的希望[3]。近年来，随着基因工程的发展，转基因干细胞移植治疗脊髓损伤成为研究热点。本实验将转酪氨酸激酶C（tyrosinekinase,TrkC）基因神经干细胞（neuralstemcells,NSCs）移植到缺血再灌注损伤的脊髓内，同时局部使用神经营养素（neurotrophin,NT）-3，观察大鼠脊髓功能恢复的情况，并探讨其可能的机制。

1资料和方法

1.1实验动物

90只Wistar大鼠，雌雄不拘，清洁级，～g，随机分为6组（每组15只）。实验在室温25～28℃的环境中进行，苯巴比妥（40mg/kg）经腹腔注射麻醉。

1.2神经干细胞的培养和鉴定

孕14dWistar大鼠，取出胎脑海马，机械消化成单细胞悬液。加入NSCs全培养液，悬浮培养、传代。

1.3转TrkC基因NSCs的制备

（1）TrkC引物设计和合成：根据Cenebank内的TrkCcDNA全长序列设计合成一对引物TrkCCDS，片段长度bp。（2）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR），回收目的片段。（3）外源性TrkCcDNA的连接：将pMD18-T质粒和回收目的cDNA片段用KpnⅠ+HindⅢ双酶切，T4DNA连接酶连接，获得pMD18-TTrkC质粒。（4）转化、扩增与提取pMD18-T-Trkc质粒。（5）TrkC基因测序。（6）pECFP-C1-TrkC质粒的构建、同步骤（3）的双酶切，pECFP-C1和pMD18-T-TrkC，T4连接酶连接，产生pEGEP-C1-TrkC质粒。（7）脂质体/pMD18-T-TrkC质粒转染NSCs。（8）免疫荧光检测TrkC和氯色荧光蛋白（GFP）的表达：一抗为兔抗TrkC和鼠抗GFP，荧光二抗为羊抗兔lgM-罗丹明和羊抗鼠lgM异硫氯酸荧光素（FTTC）。

1.4脊髓缺血再灌注损伤大鼠模型的建立与分组

于全身麻醉情况下，仰卧位固定，气管插管，安装人工呼吸器，在胸骨左缘3、4肋间开胸，撑开肋骨，暴露术野，在左锁骨下动脉末梢处给降主动脉缠胶带。全身肝素化后，在体外循环下，于左锁骨下动脉末梢处，束紧胶带，阻断降主动脉，阻断50min后，解除胶带，开放主动脉。然后经皮把温度探头放置在腰椎椎管内，监测脊髓温度。Tarlov评分2.0分，脊髓损伤脊髓缺血再灌注损伤大鼠模型建立成功。根据预实验结果及相关文献，阻断时间为50min，脊髓缺血再灌注损伤确切，又不会出现较多严重致畸甚至死亡，为理想的阻断时间。

把常温下不进行阻断降主动脉群体作为正常对照组（A组）；常温下只进行单纯阻断降主动脉群体作为缺血模型组（B组）；阻断降主动脉，同时进行单纯NSCs移植组为C组；NSCs移植+NT-3局部使用者为D组；转Trkc基因NSCs移植组为E组；转TrkC基因NSCs移植+NT-3局部使用者为F组。经过一定时间（50min）后，阻断的降主动脉被解除，整个实验过程中，持续监测脊髓的温度。闭合胸部切口，大鼠继续饲养。

1.5神经干细胞移植

于手术后1d进行细胞移植。

1.5.1途径蛛网膜下腔穿刺，单次给药。

1.5.2操作固定大鼠，自腰、骶椎处做约0.5～1cm皮肤切口，暴露皮下组织，于L5-6或L6-7间隙沿下一棘突的上方用毛细穿刺针穿刺，针尖斜向头端，针体与水平线约呈40°角进针约1.5～2.0mm到达蛛网膜下腔，仔细体会有落空感。若穿刺有误，针头未准确地进入蛛网膜下腔，注射药物时可能出现药液自周围软组织间隙漏出，或起固定作用的左手下有轻微的冲凸感；穿刺准确时则不出现上述现象。分别用10mL的Hamilton注射器经微量注射泵进行移植。每个移植点注射1.5mL细胞悬液，细胞总数为2×。移植速度为1.5mL/min。注射完毕后保护Harnilton注射器于原位约1min，再缓慢退出。随即在D、F组大鼠细胞移植同时注射NT-3，NT-3（英国PEPROTECHEC公司）的浓度为ng/mL磷酸盐缓冲液（PBS）。

1.5.3注药量为保证蛛网膜下腔压力的一致，各组均为0.5mL，A组用生理盐水。

1.6脊髓运动功能评分

各组大鼠在细胞移植后6h、24h、48h时进行脊髓运动功能评分。评分时将大鼠置于开阔平地，任其爬行，4min内观察其后肢的运动情况，采用Tarlov下肢神经功能评分系统进行脊髓运动功能评分(Tarlov评分标准为——0分：完全瘫痪，不能任何运动；1分：严重瘫痪，不能支撑身体，可有轻微的运动，但不能做类似爬行的动作；2分：瘫痪，不能支撑身体，能做爬行的动作；3分：轻度瘫痪，能支撑身体，但走时不稳，有跛行；4分：无瘫痪，行走自如)。

1.7脊髓标本的病理学检测和MAP-2的表达检测

术后24h、1周，分别处死7和8只大鼠，迅速取出脊髓标本，于4℃电镜前固定液中固定，1h后在电镜前固定液的浸润中将标本切成1mm×1mm×3mm小块，于4℃固定液中保存；将其中一半标本浸于10%福尔马林液中固定；另一半标本于﹣70℃液氮中冻存。HE、NISSLE染色观察神经元形态学变化，免疫组化观察MAP-2的表达变化。光镜下观察脊髓组织的形态学变化，依照病理评分标准分为三级：Ⅰ级为正常脊髓或胞浆内少量颗粒变性及空泡变性；Ⅱ级为中等程度核浓染与正常神经元细胞相间；Ⅲ级为大量神经元坏死、溶解。

1.8实时定量PCR法检测MAP-2的mRNA变化

各时间点大鼠处死后，快速冰上取腰段脊髓(L3~L5)匀浆，取匀浆组织约50mg，常规Trizol试剂(Invitrogen公司)抽提总RNA，DEPC水溶解沉淀,核酸蛋白分析仪(BeckmanCoulter,USA)测定RNA浓度，根据RNA在Anm/Anm≥1.8鉴定RNA纯度及完整性。取总RNA1mg用于后续的反转录实验。反转录步骤严格按TaKaRaPrimeScriptII1stStrandcDNASynthesisKit(DA）试剂盒说明进行，反应体系的配制、反应参数等均按TaKaRaSYBR?PremixExTaq?II(PerfectReal-time)试剂盒说明进行，实时PCR的扩增曲线和融解曲线应用Bio-RadCFX96Real-TimePCRSystem的操作方法进行。其中，MAP-2上游引物：5’-ctggacatcagcctcactca-3’；下游引物：5’-gccttcctcctcctctctgt-3’；管家基因选择GAPDH，上游引物：5’-TGCCACTCAGAAGACTGTGG-3’；下游引物：5’-TTCAGCTCTGGGATGACCTT-3’。PCR反应条件均为：95℃预变性10min；95℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸30s的条件下循环45次，94℃保温1min后制作熔点曲线，确定扩增产物的特异性。荧光实时定量PCR分析分别测定每个样品MAP-2mRNA和对应GAPDHmRNA的Ct值，每个样品均作复孔以减少操作误差。Ct值表示每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数呈线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。采用相对定量方式表示各样品的△Ct，△Ct=Ct目的基因/Ct内参基因。再依据△△Ct=△Ct目的基因/△Ct参照因子，计算2-△△Ct。当目的基因与内参基因的扩增效率接近时，2-△△Ct表示所检测样品相对于作为参照因子样品的目的基因的表达倍数。

1.9统计学分析

数据用（均数±标准差)表示，各组间均数的比较用SPSS版本17.0软件进行AVONA单因素方差分析。以P0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1脊髓运动功能评分

各组实验动物缺血前神经功能评分全部正常（4分）。至术后24h，I/R模型组仅少数大鼠后肢出现轻微活动，而实验组大鼠较多出现不同程度的后肢运动功能恢复，以F组大鼠后肢功能恢复情况最佳，与其他各组比较，差异有统计学意义（见图1）。

2.2苏木精-伊红染色和NISSLE染色

如图2和图3所见，A组神经元形态完整，罕见核固缩、核溶解现象，尼氏体呈块状或颗粒状，核周围尼氏体颗粒较大，近边缘处较小而细长，树突、轴突形态清晰；B组神经元损伤严重，可见凋亡细胞，神经元细胞核固缩伴淋巴细胞浸润，细胞周围多有白色“空晕”间隙，神经元胞浆内空泡形成，尼氏体变为沙粒状，染色变淡，数量急剧减少；C、D、E组各时间段均出现不同程度的神经元体积缩小，细胞核固缩深染，可见嗜酸性细胞核，部分细胞浆呈空泡状，尼氏体减少；F组脊髓神经元形态保留，结构较清晰，核溶解程度较轻，尼氏体呈颗粒状，数量明显多于其它治疗组。

2.3免疫组化法检测MAP-2的表达

在对照组和实验组观察到胞浆和胞核中出现棕黄色和棕色颗粒的阳性细胞，阳性细胞多见于前角，尤其是内侧角。如图4所见，对照组和模型组未见阳性细胞，而各移植处理组（C、D、E、F组）均可见不程度染色的阳性细胞，其中以F组染色程度最深。

2.4实时定量PCR法检测MAP-2mRNA的表达

以A组的第1只大鼠为参照因子，计算它的△Ct，△Ct=Ct目的基因/Ct内参基因。其他大鼠的△Ct目的基因代入公式△△Ct=△Ct目的基因/△Ct参照因子，得到△△Ct，从而计算2-△△Ct。2-△△Ct表示所检测样品相对于作为参照因子样品的目的基因的表达倍数。从图5可见，各移植处理组（C、D、E、F组）MAP-2mRNA均有不同程度的上升，与对照组比较，差异有统计学意义（P0.05）；各处理组的（C、D、E、F组）MAP-2mRNA的表达以F组最高，与其它各组比较，差异有统计学意义（P0.01）。

3讨论

神经干细胞是神经组织细胞最原始的细胞，能进行自我更新和自我复制，具有分裂、增殖和分化成各种类型神经细胞的潜能。但是，单纯的NSCs移植到损伤的脊髓内存在向神经元分化障碍和存活率低的问题[5]。Cao等[6]发现，NSCs在移植到损伤的脊髓后，主要分化为胶质细胞。这一现象的可能原因是，一般NSCs表面增殖分化所需受体的表达不足和脊髓微环境中神经营养因子的缺乏。TrkC是NT-3的高亲和力受体，梁日生[7]发现，过度表达TrkC受体的NSCs在NT-3的作用下，在宿主损伤脊髓内向神经元分化的细胞数明显增加，增殖和生存能力明显增强。Castellanos等[8]也发现，将过度表达TrkC的神经前体细胞移植到正常脊髓内，局部应用NT-3，移植细胞的生存率接近%，且向胶质细胞的分化减少。

本实验结果显示，与缺血模型组（B组）和其他移植处理组（C、D、E组）相比，F组脊髓神经元损伤较轻，MAP-2表达增加；与对照组（A组）和缺血模型组（B组）相比，各移植处理组（C、D、E组）MAP-2mRNA表达均有不同程度的增加，但F组的MAP-2mRNA表达增加最为明显。实验结果表明，转TrkC基因NSCs联合NT-3对脊髓缺血再灌注损伤具有较好的治疗作用，只移植转TrkC基因NSCs或移植NSCs并局部加用NT-3虽也有一定的效果，但均明显不如前者。NT-3是作为神经营养因子家族的重要成员之一，广泛分布在神经系统，对神经系统的发育与存活起到至关重要的作用[9]。有研究表明，NT-3能提高受损皮质脊髓束的存活率，还能诱导其轴突再生[10]。国内王俊梅等[11]也发现，NT-3基因修饰雪旺细胞（SCs）和TrkC基因修饰NSCs联合移植能够减少大鼠脊髓全横断损伤处的瘢痕组织，促进下行神经纤维的再生。当NSCs表面过表达TrkC受体时，能与局部使用的NT-3充分结合，增强了NT-3对NSCs存活和诱导分化的有益作用。

MAP-2是一种重要的细胞骨架蛋白，与微管蛋白结合形成微管，并同其他结构元件：肌动蛋白、微丝等相互作用构成细胞骨架[12]。MAP-2参与神经元发育、结构稳定、突起形成和突触可塑性调节，其主要在中枢神经系统神经元的树突、胞体和树突棘表达[13]。本实验结果表明，转TrkC基因NSCs移植治疗能上调大鼠缺血再灌注损伤脊髓内MAP-2的表达，从而促进脊髓功能的恢复。Du等[14]发现MAP-2高表达可能在脊髓损伤后突触结构的重建及受损神经功能代偿和修复中发挥重要作用。有研究表明，微管相关蛋白促进轴突再生与神经生长因子(nervegrowthfactor，NGF)有关。推测转TrkC基因NSCs能上调MAP-2的表达与NT-3/TrkC信号通路有关，NT-3与NSCs表面的受体TrkC形成复合体，进入细胞内，触发编码MAP-2的基因表达，增加细胞内MAP-2mRNA的水平，从而上调MAP-2的表达[15]。但转TrkC基因NSCs上调MAP-2的表达具体的分子机制尚需进一步研究。

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