3D生物打印神经组织用于脊髓损伤修复

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三维（3D）生物打印制造的体外活体神经结构，具有解剖学精度的几何结构，为神经干细胞（NSC）提供良好的空间分布环境，有望用于脊髓损伤（SCI）修复。然而，负载NSC的3D生物打印仍然面临一些巨大的挑战，如打印过程繁琐、细胞存活率低、细胞与材料的相互作用极小。为了解决这些问题，来自中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所的张志军团队利用3D生物打印技术制备了NSC负载支架，并首次探索其在体内SCI修复中的应用。

研究人员首先开发了一种由羟丙基壳聚糖（HBC）、硫代透明质酸（HA-SH）、乙烯基磺酸透明质酸（HA-VS）和基质胶（MA）组成的新型生物相容性生物墨水（图1）。HBC/HA/MA生物墨水的合成方法如下:将HBC（0.06g）、HA-SH（0.g）和MA（μL10mg/ml）在PBS（1.4ml）溶液中搅拌至完全溶解，得到溶液A。然后将HA-VS（0.g）溶于PBS（0.6ml）溶液中搅拌，得到溶液B。配制好的溶液A、B分别过滤灭菌，使用前置于4℃保存。然后将A溶液与B溶液在冰浴中搅拌10min，得到HBC/HA/MA生物墨水（HBC3%w/v,HA-SH0.3%w/v,HA-VS0.3%w/v,MA0.1%w/v）。

3D生物打印时，将NSC与HBC/HA/MA生物墨水轻轻混合在冰浴中5分钟。随后进行单罐细胞3D打印和自发共价交联，使打印出来的神经支架具有稳定的机械支撑，弹性模量为13kPa。研究人员期望此支架可呈现出类脊髓样结构，为NSC提供良好的微环境，促进NSC分化并形成神经网络，而促进脊髓损伤的神经元再生和功能恢复。

为了探究其细胞相容性，研究人员将水凝胶与细胞混合后进行了3D打印。而后孵育细胞活死染料，观察细胞能否正常存活。用免疫荧光法观察GFAP和Tuj1两种蛋白的表达，用以观察细胞的分化能力。实验结果表明，3D培养的细胞可以正常存活，且具备增殖分化能力（图2）。

为了研究生物打印支架对脊髓损伤修复的影响，研究人员采用3D打印HBC/HA/MA生物墨水制备了一种平行线性阵列的支架，以模拟脊髓白质的线性排列。将支架植入动物损伤的脊髓中，12周后取材进行评分。实验结果表明，在支架上3D培养细胞，植入动物体内后显示出了良好的修复效果（图3）。

研究人员随后对损伤脊髓的纵向切片进行组织学分析。对Tuj1进行免疫荧光染色，用以鉴定生成的神经元。结果表明，对照组缺损部位出现空洞，病变部位神经元较少，支架组出现少量神经元，而支架+NSC组病变部位周围可见大量神经元。这表明3D培养的细胞不仅能够促进神经分化，还可以抑制神经胶质瘢痕的生成。然后，研究人员对神经丝进行了染色（NF），以确定神经纤维生长在脊髓损伤区，同时，Oligo2（少突胶质细胞标记物）染色结果显示支架+NSC组病变部位有少量阳性细胞，提示少突胶质细胞再生。定量分析进一步发现，支架+NSC组的神经纤维再生和少突胶质细胞再生均明显优于其他组（图4）。

综上所述，研究人员开发了一种新的3D生物打印策略，通过方便和高效的一步3D生物打印方法来创建神经支架。3D生物打印支架从微观到宏观模拟了原生脊髓，不仅为NSC的生长和神经分化提供了理想的微环境，还模拟了脊髓白质的平行线性结构，为神经元的再生和连接提供了最佳的条件。从而在脊髓损伤大鼠模型中快速有效地恢复运动功能。本研究由中国科学院纳米技术与纳米仿生研究院的张志军教授团队和黄洁教授团队完成，于年3月25日在线发表于Biomaterials。文献信息：XiaoyunLiu,MingmingHao,ZhongjinChen,TingZhang,JieHuang**,JianwuDai,ZhijunZhang*.3Dbioprintedneuraltissueconstructsforspinalcordinjuryrepair.Biomaterials，:.

供稿：于丽丽

审校：赵润泽

编辑：陈起新

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