应用显微CT研究川芎嗪在大鼠脊髓损伤模型

脊髓损伤可导致患者丧失感觉或运动功能，对全世界人民健康造成了较大威胁。至今已有多种治疗手段可在脊髓损伤后改善患者神经功能，但效果均不理想。目前，临床对于脊髓损伤的治疗有赖于甲强龙的使用。但此药物会带来较多副作用，且其确切疗效目前仍存在争议。因此可以促进神经功能恢复同时伴有较少副作用的新型治疗方法急需被发现。

脊髓损伤常伴有微血管结构及功能的异常，从而导致局部微循环障碍并产生继发损伤。既往研究证实，充足的血供可为中枢神经系统提供修复损伤所需的营养物质；还有研究指出血管为神经细胞损伤后的轴突出芽起到了向导作用。因此，促进损伤后脊髓血管新生并提高局部血流灌注是较为理想的促进神经功能恢复的治疗方法。

川芎嗪是从中草药“川芎”中提取出的有效成分。它可以透过血脑屏障，现广泛用于缺血性脑卒中的治疗。此前的研究发现川芎嗪可以抑制炎症的发生从而促进脊髓损伤后神经功能的改善。除此之前，川芎嗪在缺血性疾病中对于神经系统产生保护作用的机制尚不明确。

此前对于脊髓损伤后血管形态学的研究是通过组织切片以及免疫荧光染色进行的，仅可获得二维图像信息。而使用近年来新出现的显微CT扫描则可获得三维的图像信息。本研究即使用显微CT技术观察大鼠脊髓损伤后微血管结构的变化，从而研究川芎嗪在促进血管生成方面的作用。

实验动物：成年雄性大鼠（Sprague-Dawleyrats）。重50-g。

脊髓损伤模型：使用改良Allen撞击法。即为大鼠行T10椎板切除术后，使用8g重物从40cm高处自由坠落至该水平脊髓组织表面从而建立脊髓撞击伤模型。

实验设计：将所有大鼠随机分为三组：①假手术组：为大鼠同样进行T10椎板切除术但不损伤脊髓，术后常规关闭伤口。②损伤对照组：造成大鼠脊髓损伤，但不进行药物干预（作为对照仅给予腹腔内生理盐水注射，剂量00mg/kg）。③川芎嗪组：损伤大鼠脊髓，并给予川芎嗪腹腔内注射；术后30分钟开始给药，每4小时给药一次，剂量00mg/kg，连续给药5天。

表1列出了研究中需要观测的所有数据及采集数据的时间点。每次采集数据每组均需要5只大鼠。测量的数据种类如下：

神经系统功能评估：对大鼠后肢功能的评价采用BBB评分法，即改良脊髓损伤大鼠功能恢复评判标准。两个记分员采用双盲法在术后第1,3,7,14,1,8天分别对各组大鼠进行评分。取两个记分员测得分数的平均值作为最终数据。

病灶面积测量（LAmeasurement）：在术后第8天进行。取出大鼠脊髓，固定，石蜡包埋，切片（厚6μm），CV（甲酚紫）染色后使用显微镜进行观察。病灶面积使用Image-ProPlus6.0软件进行描绘及测量。最终在损伤中心及距中心两侧各μm范围内每μm的位置取标本切片进行面积测量，比较川芎嗪组与损伤对照组之间的差异。

免疫荧光染色（IF）：在术后第7天及第8天进行。将大鼠安乐死，取其脊髓进行处理并切片（厚10μm），进行RECA-1及PCNA染色，后选取损伤中心位置的切片进行观察。被RECA-1染色的细胞存在于新旧所有血管中，而同时被RECA-1和PCNA染色的细胞仅存在于新增殖的血管。在损伤后第7天进行PCNA/RECA-1染色观察血管新生情况，损伤后第8天行RECA-1染色观察血管总数。计数时，分别记录各组中每只大鼠免疫荧光染色脊髓切片标本中脊髓灰质前角细胞在5个随机显微镜视野（μm×μm）下的被染色细胞总数。

显微CT扫描及微血管形态学测定：各组大鼠在术后第1,7,14,8天开始进行显微CT扫描前预处理。腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，开胸暴露心脏，经主动脉快速注入肝素盐水并排空血液，之后注入10%福尔马林固定血管结构，随后使用灌注泵经升主动脉持续泵入黄色造影剂Microfil。将灌注后的大鼠置于4℃冰箱冷藏过夜，次日以损伤点为中心切取长度为5mm的脊髓组织放置于10%福尔马林溶液中固定，一天后使用显微CT设备对此标本进行扫描。使用MicroView软件进行微血管形态学分析，步骤及参数如下：①向量化：使用软件描绘出血管的中心线。②成功绘制中心线后，计算血管网络的以下参数：血管数量；血管容积分数（VVF），即属于某一脉管系统的血管数量与整块组织血管数量的比值；血管连通性（VCV），即在某一血管分为两部分前其最大血管分支数量。

川芎嗪促进神经功能恢复

假手术组大鼠无神经功能障碍。损伤对照组及川芎嗪组均有后肢功能损伤，此两组大鼠后肢自主运动功能均逐渐恢复，BBB评分随之逐渐升高。在损伤后第7天开始川芎嗪组大鼠评分明显提高，两组评分出现显著性差异。川芎嗪组大鼠在治疗后能够持续行走，并有前后肢协调运动。相比较损伤对照组大鼠没有前后肢协调运动，有偶发持续负重行走。

图1所示为各组大鼠在脊髓损伤后的BBB评分情况。相比对照组，川芎嗪组后肢功能提高明显。在损伤后第7,14,1,8天两组有显著性差异，P＜0.05。

川芎嗪减少脊髓损伤病灶面积

脊髓损伤后第8天，观察CV染色后的病灶区域脊髓标本。

图所示为病灶面积测量。可见损伤病灶不仅局限于受损中心位置，同时也会向头端及尾端延伸。与对照组相比，川芎嗪组病灶面积更小，两组具有显著性差异。

川芎嗪增强损伤诱导的血管新生能力

图3所示为术后第7天进行的PCNA/RECA-1染色。黄色箭头所示为同时被PCNA/RECA-1染色的血管上皮细胞，是新生血管的标识。川芎嗪组（图3-DEF）新生血管明显多于对照组（图3-ABC），统计具有显著性差异。

图4所示为术后第8天进行的RECA-1染色。被RECA-1染色的细胞存在于新旧所有血管中，染色情况可反映血管总数。可见假手术组血管数最多，而川芎嗪组血管数亦明显多于对照组，且具有显著性差异。

脊髓损伤后应用显微CT评估血管三维结构的变化

图5所示为脊髓微血管三维结构。此研究通过应用显微CT技术配合Microfil造影剂的使用成功构建了脊髓血管三维结构模型。黄色箭头所指为损伤位置，可见当脊髓损伤发生时，血管总数（VN），VVF及VCV数值均明显下降，提示脊髓损伤对微血管结构造成了破坏，而随后数值逐渐升高，提示急性损伤可诱导血管生成。与对照组相比，在损伤后第7,14,8天，川芎嗪组大鼠的VN，VVF及VCV值均更高（P＜0.05），但在第8天各组仍均未达到损伤前水平。

由于在脊髓损伤时微血管结构同时直接受损，导致损伤后血供急剧下降。现在已经认识到，促进损伤后血管新生、重建局部微血管结构以及改善脊髓血流灌注可以最大程度上改善脊髓神经功能。在此研究中，作者发现与对照组相比，使用川芎嗪治疗脊髓损伤能够显著加速神经功能恢复。通过免疫荧光染色以及显微CT检查可见川芎嗪组大鼠脊髓标本中微血管密度更高，提示川芎嗪亦有促进损伤脊髓局部血管新生的作用。先前有研究表明川芎嗪可以通过抑制炎性反应和抗凋亡作用来保护损伤后的脊髓。然而对于使用川芎嗪治疗脊髓损伤时促进血管新生的作用还所知甚少。此研究首次对这一现象进行了阐述。

此前有研究发现，在大鼠大脑缺血模型中，损伤后早期在损伤中心周围的脑组织存在微血管新生的现象。此过程被认为是机体为了防止缺氧的神经元遭受进一步损伤所启动的内源性保护机制。Casella同样报道了在脊髓损伤后的一周内，会存在短暂的内源性血管再生现象，再生情况会在损伤后的第七天达到峰值。本研究发现新生血管会在损伤后逐渐增多，表明确实存在损伤后血管再生，与既往的研究相一致。但不幸的是，此种内源性机制并不能为损伤组织提供足够的修复。通过使用川芎嗪进行治疗，相比于对照组，早在损伤后第七天就可以见到大量的血管内皮细胞新生。此研究数据表明川芎嗪可以在组织缺血时一定程度上保护血管内皮细胞并促进损伤后血管再生作用。

显微CT作为进行生物标本三维可视化研究的强有力手段，已在多种不同领域中被广泛应用。为了量化脊髓损伤后微血管三围结构的变化，作者引入了VN，VVF以及VCV作为血管形态学参数。研究发现在损伤后第7，14和8天，川芎嗪组上述三项参数均明显高于对照组，这与免疫荧光染色所得到的结果相一致。这两种不同研究方式所得的结果同时表明了在脊髓损伤后使用川芎嗪治疗能够促进血管的再生。这也是作者首次同时应用上述两种研究方式对川芎嗪在脊髓损伤后微血管的重建进行全面的量化研究，成功超越二维的限制，在三维的层面上对脊髓损伤后微血管形态学改变做了描述。

此研究同时表明，显微CT可作为研究微血管修复与再生治疗手段的有力工具。但其在成像方面仍存在一些限制。因此，研发一种能够动态观察损伤或给药后微血管变化的活体扫描方式将会拥有广阔前景，值得深入探索。