Science驻留神经干细胞的潜在谱系

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1DepartmentofCellandMolecularBiology,KarolinskaInstitutet,SE-Stockholm,Sweden.2DepartmentofNeuroscience,KarolinskaInstitutet,SE-Stockholm,Sweden.

3ScienceforLifeLaboratory,KarolinskaInstitutetSciencePark,SE-Solna,Sweden.

4InstituteofTranslationalBiomedicine,St.PetersburgStateUniversity,St.Petersburg,Russia.5DepartmentofBiosciencesandNutrition,KarolinskaInstitutet,SE-Huddinge,Sweden.

?Correspondingauthor.Email:jonas.frisen

DOI:10./science.abb

Llorens-Bobadillaetal.,Science,eabb()2October

背景介绍

组织的再生能力依赖于驻留细胞对受损细胞的替代。皮肤或肠道可通过激活组织特异性干细胞完成再生，而中枢神经系统（CNS）的损伤往往产生永久性的功能缺陷，部分受损细胞永远无法被置换。成熟的脑组织和脊髓中存在神经干细胞，可被损伤所激活，但更倾向于产生可供瘢痕形成的星形胶质细胞以维持组织的完整性，这种神经干细胞的非多向分化细胞替换行为会导致功能细胞再生失败。脊髓神经干细胞的分化潜能存在于一类已被良好表征的室管膜细胞中，作者在小鼠脊髓室管膜细胞模型中研究神经干细胞募集，旨在了解是否存在更大的再生潜力，以及如何激发这种潜力，并据此设计招募驻留神经干细胞进行修复的再生策略。

研究意义

小鼠脊髓干细胞可在脊髓损伤后被重新编程而产生具保护性的少突胶质细胞，从而增强神经的修复作用。本研究揭示了小鼠室管膜细胞隐伏的转录潜能，提示通过募集驻留干细胞或可成为中枢神经系统损伤后干细胞移植的替代方法。

本文的主要内容

作者整合了单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞染色质转座酶可接近性分析（scATAC-seq，研究基因组物理结构的方法）研究小鼠成熟脊髓室管膜细胞的分化潜能，在其中发现了一种隐伏的少突胶质细胞生成的遗传程序。特别的是，系统中存在OLIG2的结合位点，该转录因子可启始发育性少突胶质细胞新生，尽管OLIG2及其关键靶基因并不在室管膜细胞中表达，但是这个位点依然具有一定的可及性。在可表达OLIG2成熟室管膜细胞的小鼠中，经过损伤刺激，OLIG2表达可引起隐伏程序和具有少突胶质细胞特异性基因可及性的增加。损伤后，潜伏程序的展开来自由室管膜细胞产生的有效少突胶质细胞，而不是由星形胶质细胞产生的少突胶质细胞。经室管膜源性细胞的scRNA-seq检测，新生少突胶质细胞遵循少突胶质细胞成熟的发展程序，包括自扩增的少突胶质前体细胞状态。这些细胞随后成熟即获得常驻的成熟髓鞘少突胶质细胞身份。此外，室间隔少突胶质细胞的产生是并行发生的，不以星形胶质细胞瘢痕形成为代价。新募集的室管膜源性少突胶质细胞迁移到脱髓鞘部位促进轴突重新髓鞘化。最后，光遗传学实验表明室管膜来源性少突胶质细胞有助于损伤后轴突传导的正常化。

Latentpotentialinneuralstemcells.

主要实验结果

1.脊髓室管膜细胞少突胶质形成调控程序的潜在可及性

小鼠脊髓中的驻留非神经元细胞群富含室管膜细胞（Fig.1A）。scATAC-seq技术整合了启动子和基因主体的可及性，scRNA-seq可检测特征性基因表达情况，二者联用可用于数据库中室管膜细胞、血管内皮细胞和周细胞的鉴定（Fig.1B,C），以此分辨脊髓中的主要的瘢痕形成细胞群。簇特异性调节区域的Motif丰都分析提示RFX等预测转录因子峰度极高，在少突胶质前体细胞（OPCs）和室管膜细胞簇中，典型少突胶质细胞谱系转录因子OLIG2和SOX10的motif的可及性均很高（Fig.1D）。上述因子在少突胶质细胞谱系细胞中有表达，但并不存在于成熟的室管膜细胞中，作者在OPCs中发现一段保守的SOX10增强子的可及性对室管膜细胞也表现出了可及性（Fig.1E）。SOX10增强子包含一个OLIG2结合位点（Fig.1F），可借此检测OLIG2结合位点的可及性是否是一种普遍现象。尽管OLIG2在室管膜细胞中并不表达，在少突胶质前体细胞中可及的OLIG2结合位点在室管膜细胞簇可及域中的丰都同样相当高（Fig.1G）。上述结果表明，少突胶质细胞再生的遗传程序在缺少关键调节因子表达的室管膜细胞中也是可实现的。

Fig.1.IntegrationofscRNA-seqandscATAC-sequncoverslatentaccessibilityoftheoligodendrocytelineageprograminependymalcells.

2.OLIG2在室管膜细胞中的表达导致少突胶质细胞潜在分化程序在损伤后的激活。

OLIG2启动SOX10上游的发育性少突胶质细胞生成，SOX10的表达意味着少突胶质细胞谱系不可逆性的发展。作者构建了Rosa-CAG-LSL-Olig2-IRES-tdTomato（Olig2-tdT）和Foxj1-Olig2-tdT小鼠（Fig.2A）用于鉴别在成熟室管膜细胞中诱导OLIG2表达能否诱导少突胶质细胞发育。他莫昔芬可诱导所有重组细胞表达OLIG2，表达量为非重组实质细胞的5倍（Fig.2B），同时制备脊髓背索切口损伤模型并分离室管膜细胞，用于染色质水平的研究（Fig.2C）。比对分析表明，在Foxj1-tdT和Foxj1-Olig2-tdT小鼠室管膜细胞中，未损伤细胞的总染色质可及性高度一致，损伤后的细胞则表现出不同的特性（Fig.2D）。为研究少突胶质细胞基因表达程序活性的变化，作者测量了个OPC高丰都且包含OLIG2结合位点的域（Fig.2E）。尽管未损伤且表达OLIG2细胞的位点可及性并未增加，但损伤刺激可提高位点可及性（Fig.2F），包括多种SOX10上游增强子，而这些域可及性的增加与SOX10表达启动密切相关（Fig.2G,H）。

Fig.2.ThelatentoligodendrogenicprograminependymalcellsunfoldsafterinjuryinthepresenceofOLIG2.

3.潜在程序的激活可诱导少突胶质细胞在损伤后的有效产生

少突胶质细胞损失可引发损伤后冗余及再生的轴突髓鞘形成障碍，作者继续考察室管膜细胞中的少突胶质细胞谱系程序可及性的增加是否能够在损伤修复过程中诱导少突胶质细胞的产生（Fig.3A）。在Foxj1-tdT损伤模型中，高活性室管膜细胞在损伤后可发生增殖和子代细胞向损伤部位的迁移（Fig.3B,C）。在Foxj1-Olig2-tdT模型中，无损伤时，重组室管膜细胞以静息态形式被限制在中央管区域（Fig.3D）；损伤后，除生成星形胶质细胞外，表达OLIG2的室管膜细胞将产生大量的SOX10阳性细胞（Fig.3E）。损伤四周后的检测表明这些SOX10阳性细胞十分充足且约有30%属于室管膜子代细胞，即室管膜衍生的少突胶质谱系细胞（epOLs），SOX10+/tdT+（Fig.3F）和tdT+细胞（Fig.3G）均呈现渐进性增殖状态。

Fig.3.Ependymalcellscangenerateabundantoligodendrocytesafterinjury.

4.室管膜源性少突胶质细胞新生在分子层面概括了发育性新生且与星形胶质细胞的产生相一致。

作者计划在单细胞水平对室管膜源性少突胶质细胞新生进行重构，分别在Foxj1-tdT和Foxj1-Olig2-tdT小鼠中，分离未损伤、术后2周、术后3周三组实验对象中的tdTomato+细胞并进行scRNA-seq。计算分析表明6簇细胞可分为两大类，分别由Sox9（4簇）和Sox10（2簇）的表达所代表（Fig.3H-J）。未损伤组（两种基因背景）的室管膜细胞紧密成簇，表明损伤未发生时OLIG2对室管膜细胞转录组的影响十分微弱（Fig.3K）。在四簇Sox9表达的细胞中，来自非损伤的一簇细胞表达最高水平的室管膜标记物，记为EP；其余三簇源自损伤组，空间上呈t分布随机邻域嵌入（tNSE）式分布，具有星形胶质细胞标记物（Vim，Gfap，Cryab）上调和室管膜细胞标记物下调的特性（Fig.3I,J），基因分析结果显示这三簇细胞与分化、迁移、胶质再生和创伤应答等功能的上调相关，作者将其命名为astroependymal1至3（AE1，AE2，AE3）以表明其源自室管膜细胞且获得了星形胶质细胞属性的特点。另外两簇具有Sox10表达的epOLs细胞并不表现出EP或AE的程序，但具有鲜明的少突胶质细胞特性。epOLs在Foxj1-tdT小鼠损伤后即刻、Foxj1-Olig2-tdT小鼠损伤后4周出现（Fig.3K）。

Fig.4.Ependymaloligodendrogenesisrecapitulatesdevelopmentaloligodendrogenesis.

使用弥散图可视化后，Foxj1-Olig2-tdT小鼠细胞以两条途径分布，室管膜细胞出现在顶角处，AE2和epOL2细胞分别存在于分支的两端（Fig.4A,B）。弥散图决定的伪时间评分密切反映损伤后的时间（Fig.4C,D），进一步支持了AE3和epOL2作为室管膜细胞分化分支的终末分化状态。这表明OLIG2较早地左右了室管膜细胞走向，一旦启动了星形胶质细胞或少突胶质细胞机制，细胞就会在各自的分支中进一步发展。

在发育性少突胶质细胞新生时，少突胶质谱系细胞将经历阶梯式分化进程。作者计算了Foxj1-Olig2-tdT模型单细胞中排名前50的少突胶质细胞成熟阶段基因表达特征得分，并将其绘成主轨迹线图（Fig.4E）。epOL实在伪时间中的进程沿着少突胶质细胞谱系分支而延伸，有序地打开和关闭特定的基因表达程序，这一现象与PDGFRA+细胞渐进性减少以及CC1+epOLs细胞渐进性增长相一致（Fig.4F-I）。此外，作者发现成熟epOLs细胞专一的表达成熟少突胶质细胞亚型5/6（MOL5/6）的Ptgds，而不表达亚型2（MOL2）的标记物Klk6（Fig.4J），说明其获得了特异性特性。以上证据表明，室管膜来源的少突胶质细胞新生可以产生转录成熟的少突胶质细胞。

5.室管膜源性少突胶质细胞对轴突的再髓鞘化

使用脊髓背索切口损伤3周模型考察epOL的再髓鞘化作用（Fig.5A），结果显示tdTomato膜与轴突外包壳髓鞘基础蛋白（MBP）从定位，提示有髓鞘化发生（Fig.5B）；与CASPR共定位，提示有髓鞘形成（Fig.5C），可观察到epOL-轴突重建和对轴突的包裹（Fig.5D），扫描电镜显示epOL-轴突接触处存在致密的髓鞘生成，源自tdTomato+室管膜源性少突胶质细胞（Fig.5E-G）。

Fig.5.Ependymal-derivedoligodendrocytescontributetoremyelination.

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6.室管膜源性少突胶质细胞支持轴突传导在损伤后的恢复

使用中度胸挫伤模型，作者进一步研究了epOLs在损伤后修复过程中的临床相关性研究，结果显示Foxj1-Olig2-tdT和Foxj1-tdT对损伤的显著不同（Fig.6A）。由于挫伤后受损面积较大，Foxj1-Olig2-tdT小鼠的epOLs数量比脊髓背索切口模型增加了3倍以上，比Foxj1-tdT小鼠的epOLs数量增加了2数量级以上（Fig.6B,C）。随后，在Foxj1-Olig2-tdT小鼠及其阴性对照Olig2-tdT小鼠中度胸挫伤模型中（两者的皮层脊髓束CST均表达ChR2-EGFP），作者考察了光诱发复合动作电位（optoCAPs）和传导速率，在距损伤部位喙侧两节脊髓表面施加光激发刺激，并在损伤后即刻检测中心点喙侧或尾侧optoCAPs的诱导情况（Fig.6D），仅在大部分动物的脊髓喙侧捕捉到信号（Fig.6E），而接受他莫昔芬注射的Foxj1-Olig2-tdT小鼠和对照组Olig2-tdT小鼠的相同解剖区域中均能记录到响应信号，这表明损伤组小鼠存在局部的CST传导阻滞，损伤可造成对照组小鼠传导速率81%的降低，而Foxj1-Olig2-tdT小鼠的传导速率维持在了28%（Fig.6F）。后续研究显示，损伤小鼠传导速率和CST再髓鞘化水平呈现一定的相关性（Fig.6G,H）。

Fig.6.Ependymal-derivedoligodendrocytessupporttherecoveryofaxonconductionafterinjury.

创新性和可借鉴之处

1.神经元无法分裂增殖，疾病损伤后发生的神经再生极为有限，与近年备受