客户文章双喜临门TMT蛋白质组学助力

编者按：

脊髓损伤（SpinalCordInjury，SCI）是导致严重神经功能障碍的最常见的中枢神经系统损伤之一，且发病率高。目前，这种疾病的确切致病机制尚不清楚，临床上治疗SCI及其后遗症的方法很多，但均未取得满意的疗效。因此，脊髓损伤后的神经修复仍然是医学界急需解决的重大挑战和临床难题。已有的研究表明，间充质干细胞（MSC）移植可能是一种有效的治疗脊髓损伤的方法，但具体的治疗分子机制尚不清楚。

近期，山东医院脊柱外科的王大川主任团队，分别在知名期刊：《BiomedicinePharmacotherapy》《DrugDesign,DevelopmentandTherapy》陆续刊登了两篇研究文章，利用SCI大鼠模型全面揭示了间充质干细胞缓解大鼠脊髓损伤的分子机制，为后期开发新的SCI治疗策略，改善脊髓损伤后的功能恢复提供重要的理论支撑。定量蛋白质组学服务由诺禾致源提供。其中，发表在期刊BiomedicinePharmacotherapy上的研究“MesenchymalstemcellderivedEVsmediateneuroprotectionafterspinalcordinjuryinratsviathemicroRNA-21-5p/FasLgeneaxis”，发现间充质干细胞衍生的胞外囊泡（MSCs-EVs）能显著改善SCI后大鼠的功能恢复，减轻损伤面积和细胞凋亡，并证明MSCs-EVs的神经保护作用是通过miR-21-5p来实现的。这一发现不仅为miR-21-5p分子机制的研究提供了新的、重要的见解，而且为SCI治疗干预新途径的发展奠定了基础。1.MSCs-EVs改善运动功能及抑制细胞凋亡将大鼠随机分为3组：假手术组（Sham）、SCI组和SCI+MSCs-EVs组，研究脊髓损伤72h后MSCs-EVs的作用。BBB（Basso,Beattie,Bresnahanscores）评分显示，SCI后大鼠即刻出现右后肢运动功能丧失，且恢复缓慢。从SCI后7天开始，MSCs-EVs组的BBB评分开始显著高于SCI组，且随着时间的延长而进一步分离（图1A）。与SCI组相比，SCI+MSCs-EVs组凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的比值（Bax/Bcl-2）也显著降低（图1C,D）。表明MSCs-EVs可以在SCI后改善运动功能及抑制细胞凋亡。

图1MSCs-EVs改善运动功能及抑制细胞凋亡

2、利用TMT定量蛋白质组学筛选差异表达蛋白

利用TMT定量蛋白质组学比较SCI组和SCI+MSCs-EVs组蛋白表达变化。共鉴定到种蛋白质，其中72种在SCI组和SCI+MSCs-EVs组之间呈现显著差异。差异蛋白以火山图（图2A）和聚类热图（图2B）的形式呈现，并使用GO、KEGG和COG等数据库对鉴定的蛋白质进行功能注释，从而了解这些差异蛋白质的功能特性。研究发现部分差异蛋白质与SCI显著相关，如凋亡（Programmedcelldeath6-interactingprotein,Bcl2-associatedathanogene-4）和炎症（AnnexinA1,NeutrophilantibioticpeptideNP-4）相关的蛋白。此结果与以前的研究一致，证明MSCs-EVs在脊髓修复中减轻炎症并发挥抗细胞凋亡作用（图2C）。

图2差异表达蛋白分析

3、miR-21-5p在MSCs-EVs及SCI后损伤脊髓组织中的表达分析利用qRT-PCR初步检测miR-21-5p在SCI后脊髓中的表达，发现miR-21-5p在SCI后4h和12h显著降低，SCI后24h、3d和7d显著升高（图3A）。miR-21-5p是MSCs-EVs中表达最高的miRNA之一，与文献报道一致（图3B）。本研究利用miR-21-5p抑制剂及其阴性对照证实miR-21-5p抑制剂显著降低MSCs-EVs和损伤脊髓中miR-21-5p的表达（图3C,D）。表明miR-21-5p抑制剂的转染成功地降低了miR-21-5p在MSC-EVs中的表达水平，促进了SCI的发生。

图3miR-21-5p在MSCs-EVs及SCI后组织中的表达分析

4、EVs-miR-21-5p下调促凋亡靶基因FasL的表达利用miRNA靶点分析工具（Targetscan和miBase）确定miR-21-5p介导神经元凋亡的潜在靶点。发现miR-21-5p与FasL基因的3′UTR具有互补性结合位点（图4A）。使用荧光素酶报告基因分析miR-21-5p和FasL基因之间存在直接相互作用，发现FasL野生型基因是miR-21-5p的直接靶基因（图4B）。SCI后，FasL基因表达明显升高，特别是12h（图4C）。而MSCs-EVs处理后，FasL基因表达会降低，但用EVs-miR-21-5pinhibitors处理则可以逆转这种影响（图4D），表明EVs-miR-21-5p下调促凋亡靶基因FasL的表达。

图4FasL是miR-21-5p的靶基因

本文通过对大鼠SCI模型进行研究，发现MSCs-EVs能显著改善SCI后大鼠的功能恢复，减轻损伤面积和细胞凋亡。利用定量蛋白质组学证明MSCs-EVs在脊髓修复中具有减轻炎症并发挥抗凋亡作用。同时表明MSC-21-5p/FasL基因轴的调控可作为脊髓损伤及其他神经系统疾病的临床治疗策略，为相关疾病的干预新途径的发展奠定了基础。

干细胞移植被认为是具有广泛应用前景的SCI治疗手段，而旁分泌作用似乎是干细胞移植治疗SCI的主要作用之一。上篇研究证明了MSCs-EVs能显著改善SCI大鼠的功能恢复，那么，在各种疾病模型中发挥重要保护作用的外泌体（Exo）又会对SCI起到怎样的治疗效果呢？另一篇发表在期刊DrugDesign,DevelopmentandTherapy上的文章题为：“ExosomesDerivedFromBoneMarrowMesenchymalStemCellsInhibitComplementActivationInRatsWithSpinalCordInjury”，以大鼠SCI模型（假手术组（Sham）、SCI组和SCI+Exo（Exosomes）组）为研究对象，利用定量蛋白质组等技术，深入探讨了骨髓间充质干细胞外泌体（BMSCs-Exo）作为无细胞疗法对大鼠SCI的作用机制。证明了BMSCs-Exo通过抑制补体mRNA合成和释放，以及与小胶质细胞结合抑制SCI激活的NF-κB，在脊髓损伤中发挥保护作用，揭示了BMSCs-Exo缓解脊髓损伤的分子机理，有助于后期相应诊疗方法的开发。1、补体系统的差异蛋白质组学分析KEGG分析显示，Sham组、SCI组和SCI+Exo组在补体蛋白富集方面存在显著差异（图1）。SCI组和Sham组间共鉴定到24个上调蛋白，这些上调蛋白主要为补体因子（Cfh、Cfp、Cfb、C5、C6等），导致SCI组补体系统激活。与SCI组相比，SCI+Exo组中发现7种下调蛋白，大鼠表现出下调补体系统某些成分的能力，导致补体系统抑制。表明BMSCs-Exo可以抑制SCI大鼠的补体系统激活。

图1KEGG通路图

2、BMSCs-Exo减弱SCI诱导的补体mRNA表达增加用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测补体mRNA的表达，证实补体系统中有8种蛋白质的相应基因（图2A）。与Sham组相比，SCI组的补体mRNA显著上调表达，而BMSCs-Exo处理后，SCI诱导的补体mRNA水平显著降低。BMSCs-Exo处理SCI大鼠72ｈ后，利用免疫组化的方法测定SCI补体系统中关键蛋白C1q的表达（图2B），发现Sham组脊髓组织中C1q阳性细胞很少，而SCI组C1q阳性细胞较多，BMSCs-Exo处理后显著降低了SCI+Exo组C1q的表达。

图2BMSCs-Exo减弱SCI诱导的补体增加

３、免疫荧光染色及WesternBlot验证免疫荧光结果显示，Iba-1在所有SCI大鼠损伤部位附近均有大量表达（图３）。在小胶质细胞中发现大量标记的BMSCs-Exo，其中大部分以小团簇的形式在胞质中聚集。

图3BMSCs-Exo选择性靶向受损脊髓中的小胶质细胞/巨噬细胞

WesternBlot分析表明，SCI会显著增加磷酸化NF-κB（p-p65）和磷酸化IκBα（p-IκBα）水平（图4），而BMSCs-Exo处理则会显著降低p-p65和p-IκBα水平。

图4BMSCs-Exo抑制SCI诱导的NF-κB活化

本研究利用蛋白质组学方法评价了三组间补体系统的变化，并用RT-PCR验证蛋白质组学数据，免疫荧光法检测大鼠脊髓损伤后BMSCs-Exo的分布，WesternBlot检测SCI激活的NF-κB水平。最终表明BMSCs-Exo可作为急性脊髓损伤的潜在治疗手段，补体系统可能是改善脊髓损伤后恢复的重要新靶点。

小编总结

两篇研究论文均通过TMT蛋白质组学首先找到组间差异表达蛋白，随后运用RT-PCR在基因层面验证蛋白质组学数据，结合免疫荧光、WesternBlot等方法增强文章说服力。本文选题新颖，研究思路清晰，逻辑严谨，投入产出比高，值得广大研究者借鉴。

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