最新进展脊髓损伤细胞治疗的研究进展及
2016-11-21 来源：不详 浏览次数：次点击标题下方蓝字“世界脊柱健康联盟”快速 调查显示，SCI在美国发病率为每百万人27～83例，患者终身护理费用平均为万美元，国家每年将为此支出70亿美元。这不仅严重影响患者生理和心理健康，同时也给家庭和社会带来极大的负担。长期以来，治疗SCI主要通过手术减压恢复其稳定性，通过药物治疗来抑制或减轻其继发性损伤，最后通过物理、心理、康复、营养等综合治疗来促进功能恢复。虽然这些治疗在一定程度上减轻了患者症状，但并未在神经功能方面取得根本的改变，因此，当今急需一种高效安全的SCI治疗方案来改变这种状况。
SCI病理生理特点
目前普遍认为SCI包括原发性损伤和继发性损伤两个阶段。在原发性损伤中，机械力破坏脊柱骨性结构，直接对脊髓造成挤压或挫伤，严重破坏神经元及血管，导致局部出血、缺血再灌注损伤和微循环障碍，继而引起继发性损伤。
继发性损伤涉及一系列复杂的细胞及分子间的相互作用，根据其病理生理变化可分为:
(1)急性期(伤后2h～2d)，主要表现为血脊髓屏障被破坏，形成水肿、缺血出血和炎症，继而生成活性氧产生脂质过氧化作用，谷氨酸介导细胞兴奋性毒性作用使胞内离子失衡，最后导致局部神经细胞死亡和周围轴突脱髓鞘；
(2)亚急性期(数日至数周)，主要表现为巨噬细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞、少突胶质前体等细胞的激活和聚集，形成以活化星形胶质细胞为主的胶质瘢痕组织并释放神经再生的抑制因子；
(3)慢性期(数周以后)，主要表现为瓦勒变性(Walleriandegeneration)和空洞形成。SCI后最终的病理生理结果是胶质瘢痕形成、神经元凋亡和残存轴突脱髓鞘，这将导致感觉运动功能的永久性缺失以及对治疗的无应答。
SCI细胞治疗
纵观SCI发生后整个病理生理变化特点，尽管脊髓在原发性损伤中受到了严重的直接损伤，但其后的继发性损伤却对神经组织产生更广泛、更持久的破坏。据统计，啮齿类动物的继发性损伤会在原发伤基础上波及周围数毫米，而人更是达到数厘米。SCI后大量神经元凋亡、坏死，正常的神经网络遭到破坏，而内源性神经细胞数量有限以及神经营养因子的缺乏，都难以满足神经再生的需要；胶质瘢痕和空洞的形成，又造成了轴突生长的物理障碍，其分泌的抑制因子组成了一个抑制微环境，使残存轴突发生广泛的脱髓鞘并抑制轴突的再生，如此形成恶性循环，进一步阻碍神经组织结构及功能的恢复。
如果能减轻或克服这些障碍，有效地恢复神经功能将有望实现。随着近年生物技术的快速发展，旨在解决此类障碍的细胞治疗逐渐获得重视，即移植干细胞，改善局部环境，促进功能恢复。这种细胞疗法对受损脊髓功能改善的机制目前还不是十分清楚，一般认为是:(1)替代作用:针对受损部位大量神经细胞被破坏，在适宜的微环境下使干细胞增殖分化为神经元和胶质细胞，替代受损神经组织，重建神经传导通路；(2)营养作用:针对局部抑制微环境和神经营养因子的缺乏，促进局部营养物质的合成和分泌，改善微环境，促进受损神经元轴突再生；(3)支持作用:针对脊髓空洞形成的物理障碍，促进细胞产生多种细胞外基质，填充空洞，为轴突再生提供支持物。随着研究的深入，终末分化细胞如雪旺细胞、嗅鞘细胞和成纤维细胞等在应用中也表现出较好效果。
细胞来源
胚胎干细胞(embryonicstemcells，ESCs)是源于囊胚内的一种高度未分化细胞，可在体外特定坏境中被诱导分化为神经细胞。这些定向分化的细胞被移植到损伤部位后可与宿主细胞整合，修复受损神经组织。Bottai等将万单位未分化ESCs通过尾静脉直接注入SCI大鼠模型，发现这些动物BBB评分显著高于其他治疗组，并观察到损伤部位巨噬细胞和中性粒细胞浸润明显减少，他们推测可能正是这种免疫抑制起到了保护作用。
Erceg等将人胚胎干细胞源性的少突胶质前体细胞和运动神经元前体细胞移植到SCI大鼠模型中发现，移植细胞分化为神经元和胶质细胞，并存活至少4个月，动物的运动功能也得到了恢复，他们也认为这种治疗作用不单因为移植细胞的分化能力，还因为胚胎干细胞源性的少突胶质前体细胞能提供一个营养环境，调节局部的免疫应答，激活内源性神经发生。
但是另一方面，有研究发现将未分化的hESCs移植到免疫缺陷小鼠体内后的8～12周形成了肿瘤，而植入hESCs源性神经元却没有这种现象，指出hESCs的低分化程度增加了其致瘤风险。除此之外，hESCs多取自流产胎儿，其中所涉及伦理、细胞数量及纯度和免疫排斥等问题都制约着hESCs的临床应用。不过，美国食品与药物管理局(FDA)已在9年首次批准了Geron公司关于hESCs的临床试验，并于年开始了首位患者移植，这无疑给hESCs的临床应用带来了巨大的希望，但遗憾的是，该公司因财务问题于年11月终止了试验。
神经干/祖细胞(neuralstem/progenitorcells，NS/PCs)是中枢神经系统内具有自我更新能力和多向分化潜能的多能细胞，最先是Ｒeynolds和Weiss等在年从小鼠纹状体中分离获取的，打破了中枢神经无再生能力的传统观念。有研究成功将人脊髓来源的神经干细胞球传25代，并将18代细胞移植到SCI大鼠，观察到这些细胞大部分能存活6周以上并检测到神经元和星形胶质细胞表型，这说明NS/PCs能在长周期培养中保持其存活率和多潜能性。
而在动物研究中，无论将NS/PCs移植到正常还是受损组织，都未见有细胞发生癌变的报道。NS/PCs在一定条件下只能分化为神经元和胶质细胞，较容易得到所需细胞类型，相对于其他细胞移植，NS/PCs移植拥有独特的优势，即移植后能在中枢神经特定区域中分化成具有相应表型的各种神经细胞，并可能重建联接；还能通过传代、分离，使干细胞不断自我更新，产生足够量的移植细胞。NS/PCs移植到体内后，发生终末分化生成神经元或胶质细胞，使其不再具有干细胞快速增殖的能力，因此，NS/PCs被认为是一种安全可靠的临床移植细胞。
间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是一种具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，最初由骨髓中获得。MSCs易于扩增、保存，捐献简单容易接受，所以被研究用于治疗SCI，而其中骨髓间充质干细胞(BMSCs)因其容易获取并用于自体移植，最大程度减少侵入性操作而受到广泛 Nakajima等将未分化MSCs植入SCI挫伤模型后，发现能显著上调IL－4、IL－13，下调TNF－α、IL－6，从而使巨噬细胞表型发生改变，最终相比于其他组，减少了瘢痕组织形成和轴突、髓磷脂的损失，更重要的是改善了动物运动功能。Gu等将BMSCs移植到SCI大鼠模型后，观察到脊髓空洞体积减小，残损白质增加，虽然并未检测到神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞标记物，但却通过电子显微镜发现轴突数量增加。
这些研究表明，MSCs的治疗作用不是替代受损组织，而是通过分泌细胞因子和神经营养因子如脑源性神经生长因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等来提供营养支持，调节免疫反应，改善微环境。与其他细胞相比，BMSCs容易从骨髓提取分离，移植回体内也没有免疫排斥的危险，因此，近年来BMSCs自体移植治疗SCI的临床试验在许多国家开展，并取得了较为可观的效果。
雪旺细胞(Schwanncells，SCs)是分布于周围神经系统中包绕轴突形成髓鞘的胶质细胞，在外周神经损伤后的轴突再生及再髓鞘化过程中扮演重要角色。实验发现，SCs能通过分泌各类神经营养因子如NGF、BDNF和CNTF等促进受损神经元的存活及再生，并能分泌各种细胞粘附分子和细胞外基质蛋白，给轴突再生提供“桥梁”。
SCs易于获取和分离，可自体移植而无免疫抑制，被认为是一种理想可行的移植细胞。Saberi研究组对33位SCs自体移植患者进行2年随访，没有发现严重并发症及肿瘤的产生，这在一定程度上说明了SCs移植的安全性。年7月，FDA批准了迈阿密大学关于SCs移植的一期临床试验研究。
嗅鞘细胞(olfactoryensheathingcells，OECs)是存在于嗅觉系统中的一种特殊类型的大胶质细胞，分布于嗅神经、嗅球的第1、2层和嗅上皮，并迁徙于周围神经系统和中枢神经系统中，是目前发现的唯一一种在成熟阶段还具有生长能力的神经胶质细胞。许多研究表明，嗅鞘细胞移植能促进远距离轴突再生，使脱髓鞘轴突重新髓鞘化，并发挥神经保护作用。
不同于雪旺细胞只包裹单条神经轴突，OECs能紧密包裹成束的无髓神经纤维，使胶质细胞在损伤时产生的轴突再生抑制因子不能作用于损伤神经纤维，从而为轴突生长提供了适宜的微环境。Su等在观察取自活体和培养的OECs时发现，活体OECs呈细长薄层状，而培养OECs却呈现为多种形态如扁平状、双极状、三极状等，甚至表现出不同的抗原，他们推测这种改变可能是受细胞来源、供体年龄、分离培养方法等不同因素的影响，而这种性质将有助于OECs通过改变自己性状去发挥不同作用和适应不同环境。
国内外近几年对OECs临床试验做了很多研究，不同程度地肯定了OECs对SCI的治疗价值。Lima等对7例脊髓损伤患者(损伤时间为6个月～6.5年)进行自体嗅粘膜组织移植，术后显示患者的神经功能有不同程度的恢复，证实嗅粘膜自体移植安全可行，有潜在的修复作用。
此外，诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPScells)也被证实了移植可行性，iPS细胞技术是利用病毒载体将4个转录因子(Oct4，Sox2，Klf4和c－Myc)复合体转导进入大鼠成体纤维母细胞中，使其诱导为类似胚胎干细胞的一种具有自我更新修复能力的细胞类型，然后进行体外诱导分化，得到理想的干细胞类型，这无疑解决了获取hESCs所面临的伦理问题。
但是，iPS细胞也存在胚胎干细胞类似的问题，如致瘤性。将不同组织来源的大鼠iPS细胞克隆植入免疫缺陷小鼠的大脑中发现，不同来源的iPS细胞之间，虽然神经分化能力没有明显差异，但是致瘤性却相差很大。另外iPS细胞还有其独有的风险，即在其培养过程中使用了病毒载体和外源性基因，如何保证这些外源性的基因组在体内不产生异常表达或者污染，也是iPS细胞在临床使用前必须解决的问题。
移植方案
移植时间:移植细胞的存活率对细胞治疗的效果至关重要，但脊髓损伤后大量的炎症因子及毒性物质都不利于移植细胞的存活、增殖、分化。因此需要一个适宜的移植时间来提高移植细胞的存活。SCI后急性期内各种炎症因子迅速达到峰值，虽然低浓度炎症因子可发挥一定的神经保护作用，但至少在7d内为极端的神经毒性作用；而具有抗炎作用的转化生长因子β(TGF－β)在损伤后却是缓慢上升，在第4d才达到峰值。而一旦处于慢性期后，损伤处胶质瘢痕成熟，将成为轴突再生的物理障碍而难以克服。
因此，亚急性期移植是个理想的选择。不过也有一些研究者认为在SCI急性炎症反应期进行移植，可改变损伤后抑制微环境，阻断一些恶性循环，减轻脊髓损伤早期大量神经细胞凋亡，缓解脊髓继发性损伤。综合国内外研究，较为一致的观点认为在SCI后7～14d内移植合适。移植方式:目前国内外所采用的细胞移植方式很多，包括直接局部移植、经静脉移植、腰椎穿刺移植等。
在大部分试验中，采用直接向损伤部位移植细胞，这虽然在很大程度上保证了病灶的治疗细胞数量，但却需要二次手术，可能因手术风险或感染造成二次损伤，同时也会增加患者的经济负担；而经腰椎穿刺和静脉移植，虽然损伤较小，并能行多次移植，但到达目标部位的细胞数量有限。对于哪一种是最合适的方式，目前还未形成共识。不过有研究发现经皮移植能使细胞准确到达脊髓损伤部位，避免了手术暴露，操作也相对简单，具有潜在的优势。
细胞优化:SCI后的抑制性微环境不利于细胞存活，并影响细胞的分化增殖，从而降低治疗效果。而随着分子生物学的快速发展以及对SCI分子机制的研究，转基因治疗在细胞移植方面的研究取得了显著的进步。通过基因转染技术，修饰细胞特异表达所需物质，针对性的改善局部环境，提高移植细胞的疗效。
Liu等将表达bFGF的MSCs移植到SCI大鼠，3周后观察到大量bFGF阳性神经元，BBB评分显著高于对照组。另一项研究中，Hwang等将转染表达Olig2的NSCs移植到SCI动物模型内，7周后观察到该细胞大量增殖，空洞体积缩小，并检测到髓鞘增厚，后肢运动功能得到显著改善。
多细胞的联合应用也能相互优化，产生协同效应。有研究表明，将MSCs和SCs联合移植到SCI模型后，明显增强了轴突再生，抑制了星形胶质细胞的增殖，并观察到了脱髓鞘轴突的再髓鞘化，BBB评分也显示联合移植组较其他组后肢运动功能恢复明显；将NSCs和SCs联合移植到SCI半切大鼠模型中，SCs能促进NSCs的存活、迁移以及向神经元样细胞的分化；将OECs和SCs及软骨素酶联合植入SCI大鼠模型中，结果其神经功能获得很大恢复，轴突髓鞘化及纤维网状化效果明显。这些都显示联合治疗效果优于单一方法治疗。但也需注意，不是所有细胞联合移植都会得到理想的效果，有实验将MSCs和OECs联合移植，却并未表现出更好的疗效。
随着组织工程技术的发展，一种新的移植策略受到了 问题与展望
细胞治疗作为一种新的、最有希望的SCI治疗手段，它改变了以往对神经损伤束手无策的状况，这对于广大受困于脊髓损伤的患者来说无疑是一个福音。但它要形成一种成熟并能用于临床的治疗方法，还面临着一系列问题。目前，大量研究成果来自于动物模型，特别是啮齿类动物，虽然结果显示，不同来源的细胞移植对脊髓损伤均有一定的疗效，行为学检查也观察到了一定的运动、感觉功能改善，但也看到，许多临床试验结果与这些“可喜”成果之间存在的显著差异，这不得不引起我们的思考。
相对于人类来说，啮齿类动物模型是否合适？能不能更多的采用大的、接近人类的动物如灵长类？细胞治疗理想的时间窗是急性期或亚急性期，但面对大部分患者都处于慢性期的现状，我们该如何处理这种矛盾？对于各种同类研究甚至相同研究所得结果之间存在的差异，我们该如何看待？模型的制备、细胞的培养、移植的方法等如何标准化？大量研究使我们获得了较多的动物SCI机制，但人类SCI机制研究却很少，有研究发现动物和人类SCI机制虽然基本相似，但仍存在差异，又该如何开展这方面的工作？SCI涉及一系列复杂的问题，损伤脊髓的修复将是一个长期的、个体化的、多学科参与的大工程，这就需要对这些问题作进一步的研究。相信随着生物工程、分子生物学等学科的进步，目前的障碍会逐渐得到解决。
作者：医院野战外科研究所李森
